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卵浆内单精子注射(ICSI)实验室的建立
发布:2011-01-28 10:06:54  来源:环球母婴  查看:3892次  字体:     打印 关闭

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[环球母婴网导读]卵浆内单精子注射(ICSI)实验室的建立
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ICSI实验室的建立   ICSI治疗必须建立在成功地IVF治疗的基础之上,成功地IVF实验室是进行ICSI的先决条件,因为进行IvF的所有仪器、设备、实验室条件和进行精卵熟练操作的技术人员都是进行ICSI所必须的。   首先对于显微操作者,要求他们要有耐心并且细心,动作细致,观察认真,并能持之以恒,在付出大量时间与精力后,才能建立成功的显微操作系统。   ICSI所需的主要仪器是一台倒置显微镜和一套显微操作臂及其控制系统。倒置镜配备有×10、×20和×40的物镜头,安装显微针后在×10倍镜下调节其至适当的位置,进行显微操作则在放大200倍或400倍下进行。倒置镜一定要清晰,并连接有闭路电视系统,可以监视,录像可教学。而且安置显微镜的工作台一定要平稳,不易受外周环境振动的影响。显微镜台上一定要有温度控制装置,维持卵子所处的环境温度在3T℃;显微操作仪由显微操作臂及二种控制系统组成,在显微操作臂上分别安置固定针及注射针,一套控制系统调节显微针在三维空间实时活动,又分为粗调与微调,另一套液压或气压传动的连接有注射器的控制系统调节显微针内液体量的进出。   其他所需仪器有:制备显微针所需的拉针器及锻针器,配制试剂所需分析天平,测) pH计,测渗透压计及纯水生产系统   (MilliQ)。还要常规IVF所必需仪器如培养   箱,离心机等。   一、所需材料   (1)微孔过滤器(Millex-PF,0.22t~m或0.45um);   (2)无菌培养皿(Falcon 1006,3037);   (3)无菌离心管,大小试管(Falcon 2099,2003);   (4)无菌玻璃吸管(pasteur pipettes,BDL4642);   (5)毛细玻璃管(内径0.75ram,外径lrnm,长100mm);   (6)显微注射针(Cook IVF,K-MPIP-1035);   (7)显微固定针。   二、所需试剂   (1)Hepes平衡液1M(Gibco,15630-106);   (2)Earles液(E一7883,Sigma);   (3)Earles液10(E一7510,Sigma);   (4)透明质酸酶TYPE III(H3757,Sig-ma);   (5)聚烯吡酮(PVP,P一6755,Sigma);   (6)矿物油(M一8410,Sigma);   (7)青霉素(P一3032,Sigma);   (8)硫酸链霉素(S-6501,Sigma);   (9)丙酮酸(P一2256,Sigma);   (10)碳酸氢钠(S-7561)Sigma);   (11)Percoll(P1644,Sigma);   (12)水(W一3500,Sigma);   (13)肝素钠;   (14)氢氧化钠。   三、主要溶液的配制   (1)Hepes平衡Earles液的配制(简称Hepes-EBSS)   配方:   总体积 250.0ml   丙酮酸钠(0.033g/12.0m1) 3.0ml   青霉素(O.036g/12.0m1) 5.0ml   硫酸链霉素(0.045g/12.0m1)5.0ml   EBSS(10×) 25.0ml   水 181.0ml   碳酸氢钠(0.118g/m1) 10.0ml   Hepes(14.9g/250ml,pH 7.35~7.40)   21.0rnl   最后,调节pH在7.35~7.40之间,渗透压在于80--285mOsm之间。   (2)10%PVP的配制。o将0.3gPVP用3ml Hepes-EtkSS溶解后,过滤,分装于数支小管内,置一20℃保存待用。   (3)80~100Iu/L的透明质酸酶的配制:每小瓶透明质酸酶TYPEⅢ(H3757,Sigma)含有100mg,其活性度lmg=330IU,即将其溶于400ml Hepes-EBSS,再分装后置一20℃保存。   (4)矿物油的处理:将Hepes-EBSS与矿物油按1:2的体积加入50ml的培养瓶中,拧紧瓶盖,猛烈摇动直到成为乳剂,然后在37℃平衡2天后使用。   (5)Earles培养液与Pereoll洗精液的配制按常规IVF_ET方法配制。   (6)精子冷冻保护液的配制见第33章。   四、显微操作的准备工作   (一)注射针的制备   目前商品化的注射针规格规范统一,清洁无菌,独立包装省去了自制的麻烦,现在许多中心都购买注射针进行ICSI,可用CO.k公司显微注射针   (二)固定针的制备   将商品化已经过清洗去除尘渣而密封保存的外径为1.0mm,内径为0.75mm硼硅酸盐毛细玻璃管置于显微拉针器上。固定,设置拉力为4格,双边固定长度为0和40mm,工作电流设为6.6mA,将中间长约1cm的一段加热后拉至外径为120um.从此处将其折断为二。将其中一段固定于显微煅烧器的一侧,显微煅烧器的另一侧连有一条可被加热的铂丝,通电与断电造成铂丝上的玻璃小球的热胀冷缩,将已拉细的毛细玻璃管切断,达到断面平整而垂直。然后将玻璃小球与毛细玻璃管的断面放在同一水平,适当的距离,通电后。发热的玻璃球可将毛细玻璃管断面煅烧成垂直而光滑的,内径为30~50um的显微固定针。然后在显微煅烧器上,将固定针顶端O.5mm处烧弯成一定的角度(约30.),利于固定针可以水平地固定卵子。最后将制备好的显微固定针置于干净密闭的玻璃器皿内,使用前在150℃:的烤箱中消毒l~2小时。   (三)胚胎生长液滴(GM)的准备   根据卵子的多少,在大或小培养皿中用含10%灭活血清的培养液25v1做成数个液滴,上盖矿物油,置培养箱中平衡1小时以上,待用。   (四)实验室精子的分离   (1)少弱精精液可用Percoll法处理。严重少弱精者可将液化后的精液加入l~2倍的培养液混匀离心(1000r·pm×10mir.)留沉淀待用。   (2)行附睾穿刺抽吸取精术时,常在注射针筒中预先吸入lml培养液,抽吸附睾液后,连同lml培养液注入培养皿中,这样防止少量的附睾液粘在穿刺针筒中损失掉;另一方面也便于观察抽吸液中精子的浓度,但这样又稀释抽吸液,因此常需离心(1000r1)m×10min)后使用,若其中活动精子计数较高,如>10/HP也可直接使用   (3)用睾丸精子ICSI时,先将曲细精管用两张玻片或两支针撕碎,再将此混悬液吸人离心管中,静置培弊箱孵育一段时间,直到用前,反复吹打混匀,再静置数分钟,待大块组织沉淀后,将上层液体离心(1000rpm×10min)后使用。   (五)ICSI操作皿的准备   用10%聚烯吡酮(PVP)溶液划写两个椭圆,然后将含精子的沉淀少许加入左侧椭圆形PVP液的下角,在PVP液滴的上方用-含}Iepes平衡盐的Ear1eS液(卜)epes-F{BSS}5~10td做数个液滴,每一滴为放入一个卵母细胞用,液滴数目即一批注射卵子的数目,按操作者经验及习惯而不同。然后上盖矿物油,置培养箱中预热数分钟,并等待精子从沉渣中游出至液滴边缘后即可加入准备好的卵母细胞进行ICSI操作(图34-1)。   (六)卵母细胞的处理   卵母细胞必须去除其周围的颗粒细胞,先将其置于含80~100Iu/ml透明质酸酶的Fepes-EBSS中连续吹打数次,然后将卵子吸-出置于HIepes-EBSS中,换用内径为130~150btm的毛细玻璃管继续吹打,直到几乎完全去除颗粒细胞。再将卵子用Hepes一:EBSS液冲洗数次,培养至进行显微注射时,加入已准备好的ICSI皿中。   (七)显微注射系统的建立   (1)进行显微注射前,将左右两侧的显微操作仪的注射器及连接塑料胶管内充以无毒的矿物油(M-8410,Sigma),避免管内残留气泡。   (2)显微操作仪的塑料胶管的一端连接有金属持针器,左侧的显微操作仪塑料胶管的金属持针器上安置显微固定针,右侧的显微操作仪塑料胶管的金属持针器上安置显微注射针,两支注射器分别固定在微量控制泵上,以控制注射量。   (3)将固定针及注射针内注入矿物油,注意不要产生气泡。若为RI仪,则固定针及其连结塑料管内不能注入矿物油,因其为气压转动控制系统。   (4)在低倍镜下,调整固定针与注射针两两相对成一直线。   (5)将准备好的IcsI皿(Falcon 1006)放入倒置镜台视野中即可进行显微操作。   五、显微注射   (一)ICSI操作步骤   (1)将注射针降低放入干净的PVP液滴中,旋转控制注射器的微调,调试注射针液体的进出速度。   (2)再将注射针放人含精子的PVP液滴中,挑选形态正常的活的精子,吸人注射针内,移至一干净的PVP液中在其尾部中段猛烈制动,然后再将精子从尾部吸入注射针,抬高注射针。   (3)移针至含卵子的液滴,用固定针将MⅡ期卵母细胞通过负压轻轻固定,第一极体在12或6点处,避免注射过程对卵母细胞纺锤体的损伤,Blake却认为第一极体在8点处时注入精子最好,这样精子注入在纺锤体附近,但不在纺锤体中。   (4)沣射前记录卵子的形杰特点(表34-1)。   (5)注射时先将精子移到注射针内[处,调整注射针、固定针内口及卵膜在同一水平后进针,穿过透明带后继续进针,同时不断调整平面,可以看到卵膜随注射针的顶人弹性伸展进入卵浆中,这时不要将精子注入卵膜形成的陷窝内,如果这样,精子其实是注在了卵膜外。穿刺卵膜近卵子中间时,可见卵浆回弹包住注射针,表明刺穿了卵膜,偶尔也见到尽管注射针已刺入接近9点处的卵膜。但仍未刺穿卵膜,可能是卵母细胞胞浆张力不够的原因,这时可稍稍回抽针尖,调准平面再较快速进针。可刺穿卵膜近卵子中间时,可见卵浆,当卵浆开始快速吸人注射针时,表明卵膜已有破裂口,立即停止回吸,转而注入吸出的卵浆及精子,再迅速出针,尽可能少地注入PVP液。注射完毕观察卵膜回复正常位置,并观察精子注入的部位是否随卵膜的回复而至卵膜外,注入PVP的量及是否有卵浆的外漏及卵子的损伤。   (6)将卵子从固定针上松开,提高显微针,并将注射后的卵子用培养液冲洗后置GM中培养。   (7)完成有关记录:精子制动方式(表34-2)、注射类型(表34-3)及特殊情况或现象   六、注射后的卵子的培养   与胚胎移植   将ICSI后的卵细胞在GM中培养约16小时后,观察受精情况,约40小时后观察受精卵有无卵裂并将胚胎进行评分,然后选择质量较好的胚胎移植人子宫,每次移植的胚胎不超过4个。   七、注射后多余精子的处理   多余附睾或睾丸精子须冷冻保存。   特殊病例多余精子或曲细精管送组织学检查或电镜观察。

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