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胚胎冻融
发布:2011-01-28 10:15:32  来源:环球母婴  查看:3715次  字体:     打印 关闭

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[环球母婴网导读]胚胎冻融
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(一)适应证   (1)促排卵周期胚胎移植后有剩余胚胎需要保存。   (2)促排卵周期发生严重的OHSS,为防止妊娠后病情加重,需将胚胎保存至以后移植。   (3)促排卵周期进行胚胎移植时插管入宫腔失败或非常困难,对子宫刺激较大,不利于着床,应保存胚胎至以后周期再移植。   (二)技术程序与方法   胚胎可于双原核期、2~8细胞期或囊胚期进行冻存。其中双原核期与2~8细胞期(合称早期胚胎)冻融程序相同。   1.早期胚胎冻融方法   (1)缓慢降温一快速复温法:此法最常用。   ①冷冻液与解冻液的配制:胚胎冷冻用PROH和蔗糖做冷冻保护剂。溶液现配现用效果较好,配制后需经0.2um针头滤器抽滤。   冷冻用溶液I(5mg/ml HSA):.50mg HSA+10ml PBS.   溶液II(1.5M PROH):0.5m1PROH+4ml溶液I.   溶液III(1.5M PROH/0.1M蔗糖):0.154g蔗糖完全溶解于4m1溶液I中,再加O.5ml PROH.   复苏用溶液Ⅳ(1.5M PROH/0.2M蔗糖):0.2805g蔗糖完全溶解于3.65ml溶液I中,再加0.45ml PROH.   溶液V(O.2M蔗糖):O.561g蔗糖完全溶解于8.2ml溶液I中。   溶液Ⅵ(1.0M PROH/0.2M蔗糖):2ml溶液IV+lml溶液V.   溶液Ⅷ(O5M PROH/0.2M蔗糖):lml溶液Ⅳ+2ml溶液V.   现在已有商品化的即用型冷冻液复苏液出售,应用方便,但价格较高。   ②冷冻程序:首先挑选冷冻胚胎。卵裂球规整均匀或略不均匀,无核碎片<50%者可用于冷冻。冷冻液保持室温,处理胚胎前先使程序冷冻仪达到起始温度20℃。将胚胎在溶液I中漂洗数次,转移至溶液II中放置10分钟,此期间用溶液I漂洗冷冻管并做好标志,转移至溶液III后三段法装冷冻管,封管后放人程序冷冻仪启动程序,整个过程不超过20分钟。   降温程序:一2℃/分钟,从20℃降至一7℃,停留5分钟,植冰,也就是将冷冻管从冷冻室中稍提出,用在液氮中预冷过的镊子夹无胚胎的溶液段,待形成白色冰块即迅速放回),停留10分钟,一0.3℃/分钟,从一7℃降至一30℃,一lO℃/分钟,从一30℃降至一120℃,投入液氮保存。   ③解冻程序:培养液在37℃、5%COz条件下过夜平衡,复苏液平衡至室温,准备好30℃水浴。从液氮中取出冷冻管,空气中40秒,30℃水浴40秒,剪断冷冻管,后接带气柱的TB注射器,将胚胎注入溶液VI,然后依次移入溶液Ⅶ、V,分别停留5分钟。再移人溶液I停留10分钟,使温度缓慢升至37℃,最后移人培养液中置37℃、5%C02条件下培养至移植。复苏后无核碎片<50%、50%以上的卵裂球保持正常的胚胎被认为经历了冻融依然存活,可用于移植。   需要注意的是,以上程序中的时间应严格掌握,时间上的误差会严重影响冻融效果。   (2)超速冻融:   采用高浓度的冷冻保护剂(如4.5M的DMSO或PROH),胚胎在冷冻保护剂中放置2~3分钟后直接投入液氮保存,复苏时从液氮中取出麦管,22℃水浴解冻,室温下在含1.0M蔗糖、5%血清的PBS中放置10分钟,换置培养液中继续培养。本方法不需程序冷冻仪,操作简单,且高浓度的冷冻保护剂在超速降温时不形成冰晶,但成功率较低。   (3)玻璃化法:采用多种冷冻保护剂配制成高浓度的玻璃化冷冻液,由于其在降温时通过粘度极度增加,形成无结构的玻璃状态,不形成细胞内结晶,所以不需充分脱水,跨膜浓度与渗透压差不大,不易产生不可逆的细胞膜损伤而引起细胞死亡,且冻融过程采用超速降温与快速复温,操作简便,理论上讲可以克服慢速冷冻的缺陷;但高浓度的冷冻保护剂对胚胎的毒性与致畸性增加,使冻融胚胎成功率不理想,阻碍了玻璃化法的应用,所以如何选择配制合适的冷冻液是其研究的重点。   2.囊胚冻融方法   采用慢冻一快融法。   (1)冷冻、解冻用溶液:以甘油与蔗糖作为冷冻保护剂。现用现配,配制后0.2um针头滤器抽滤。现在已有商品化冷冻液与解冻液出售。   冷冻用溶液l(5mg/ml HSA):50mg HSA+10ml PBS.   溶液2(5%甘油):0.2ml甘油+3.8ml溶液1.   溶液3(9%甘油/0.2M蔗糖):0.2738g蔗糖完全溶解于3.64ml溶液l中,再加0.36ml甘油。   解冻用溶液A(10%甘油):0.4ml甘油+3.6ml溶液l.   溶液B(0.8M蔗糖):1.0954g蔗糖完全溶解于4ml溶液l中。   (2)冷冻程序:准备程序冷冻仪至起始温度20℃。冷冻液保持室温。将囊胚在溶液1.中漂洗后转移至溶液2中停留10分钟,停留期间用溶液1漂洗冷冻管并做标志,再转移至溶液3中停留10分钟后,迅速采用三段法装冷冻管送入冷冻仪。降温程序为:一l℃/分钟,从20℃降至一6℃,停留30秒,植冰,停留10分钟,一0.3℃/分钟,从一6℃降至一37℃,一30℃/分钟,再从一37℃降至一120℃,投入液氮保存。   (3)解冻程序:准备好解冻液、囊胚培养液与30℃水浴。从液氮中取出冷冻管,空气中40秒,30℃水浴40秒,剪断冷冻管,后接带气柱的TB注射器,将胚胎注入溶液4,停留5分钟,然后依次移入溶液5、6、7、8、9,分别停留6、7、7、6、2分钟,溶液保持室温。再移入溶液10停留10分钟,使温度缓慢升至37℃,最后移入培养液置37℃、5%C02条件下培养至移植。-   3.冻胚移植   冻胚移植共有三种周期准备方法:自然周期、促排周期与人工周期,根据患者病情不同进行选择,前两种方法成功率较高。   (1)自然周期法:用于月经周期规律,有自然排卵的患者。于预计排卵前5天开始阴道B超监测卵泡发育情况。当主导卵泡直径达1.4cm时,开始每8小时测1次尿LH以监测LH峰值,于卵泡直径达1.8cm,LH峰值前肌注HCG 10000Iu,然后监测排卵(亦可不用HCG)。排卵后36小时移植2~5细胞冻胚,60小时移植6~8细胞冻胚,108小时移植冻囊胚。若无卵则根据HCG注射时间为基准,注射后72小时移植2~5个细胞冻胚,96小时移植6~8细胞冻胚,144小时移植冻囊胚。胚胎需解冻后培养2小时以上移植,亦可移植前一天解冻培养过夜,以观察融胚的继续发育情况。   (2)促排周期法:用于月经周期不规律或无排卵患者。常用CC/HCG方案,目的是为了有1~2个卵泡发育成熟,当卵泡直径达2.0cm或尿LH峰值出现时,注射HCG以模拟自然周期。以排卵时间或HCG注射时间作为基准计算移植时间,算法同自然周期。亦可用HMG/HCG促排,但需小剂量用药以防卵泡发育过多。   (3)人工周期法:用于闭经、月经不规律、无排卵且对CC及小剂量HMG无反应的患者。于月经第1天开始每天口服补佳乐4~6mg,10天后开始监测内膜发育,当子宫内膜厚度达10mm时,当日肌注黄体酮60mg,次日起改成每天80mg,直至诊断有妊娠为止。注射黄体酮3~4天后移植冻胚,移植时间掌握在周期14~16天。

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