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生殖医学冷冻技术
发布:2011-01-28 10:16:34  来源:环球母婴  查看:3786次  字体:     打印 关闭

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[环球母婴网导读]生殖医学冷冻技术
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在生殖医学领域中,冷冻技术应用广泛。在人类体外受精与胚胎移植 (IVF -ET)治疗中,使用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a),促卵泡素 (FSH),人类绝经期促性腺激素(HMG),人绒毛膜促性腺激素(HCG)进行控制性超排卵(COH),一个卵巢刺激周期的获卵数,受精后发育成的胚胎常多于移植所需的2-4个胚胎,将近一半的IVF-ET治疗周期有剩余的胚胎,如果能将这部分胚胎冻存,以后放回宫腔,可增加一次取卵的受孕机会。此外,在IVF治疗中胚胎冷冻技术还可用于:①当该周期发生严重的卵巢过度刺激综合征时,避免其进一步加重,可将胚胎冻存留待以后移植;②胚胎移植时插管入宫腔非常困难者;③胚胎活检后等待诊断结果或须排除供配子者HIV感染。胚胎冻存可在原核期,卵裂早期和囊胚期进行。   此外,还有将卵子冻存,即将COH中多余的卵子冻存或将以后不能再有机会产生卵子的妇女(如必须接受卵巢切除或放疗、化疗的病人)的卵子冻存,为日后需要生育时借助助孕技术达到生育的目的。卵子冻存后所建立的卵子库还可为卵巢早衰,染色体异常的妇女提供卵子捐赠。   精子冷冻在不育治疗中也占很重要的部分,其作用有:   (1)将正常供者精液冷冻保存,建立精子库,给因无精症的不育夫妇进行供精宫腔内人工授精治疗。   (2)肿瘤患者在接受化疗、放疗前将精液冷存,供以后生育用。   (3)精神异常紧张或需出差者,在需要受精时不能提供精液,将他们任何时候射出的精液冻存作为储备。这可能会减轻精神紧张者的思想负担,在需要时可以获得精子。   (4)冻存少弱精精液,特别是经显微附案手术(MESA)或睾丸活检(TESE)获得的少量精子。   精液冷冻后,精子质量明显下降,表现在精子活动率及活动力下降,顶体结构及顶体酶活性下降,使受精率下降。但由于单精子卵浆内注射技术(ICSI)的发展,使用冷冻精子也能获得好的受精率,卵裂率及妊娠率。这是由于相当一部分冻融精子可以保持其核和中心粒的完整性,而且将MESA,TESE手术获取的部分精子分数管冻存,为下次ICSI治疗使用,可避免患者多次手术及术后并发症带来的肉体及精神痛苦。临床上已有用MESA和TESE获得的精子冻存,再次ICSI而妊娠且分娩正常婴儿的报道。   冷冻技术原理   利用冷冻技术将胚胎和配子从生理温度降至低温并贮存,需要时,再从低温状态解冻至生理温度。为增加胚胎和配子对冻融过程的耐受,增加存活率,必须选择合适的物质作为冷冻保护剂。   胚胎不同与配子,所以须选用不同的冷冻保护剂和冷冻方法进行冷冻,但它们都是活的细胞,对耐受冷冻与融解过程有相似的机理,以下以胚胎为例说明。   一、常用冷冻保护剂   1.渗透性保护剂 如丙二醇(PROH),二甲基亚砜(DMSO),甘油(glycerol)等小分子化学物质,容易渗透入细胞,也称为细胞内冷冻保护剂。   2.非渗透性保护剂 包括单糖如葡萄糖、果糖,双糖如蔗糖、麦芽糖等,它们不能进入细胞,利用它增高细胞外溶液的渗透压而引起非特异保护作用,又称细胞外冷冻保护剂。   二、冷冻保护剂对胚胎的影响及机制   (一)毒性作用   为证明其毒性,将胚胎置于不同的冷冻保护剂一定时间,却不将其冻融,再继续观察胚胎的发育,发现在22℃时,停留在PROH的胚胎失活率高于DM的,而在4℃时,暴露于此两种冷冻保护剂几乎未发现其对胚胎有不良影响。但经冻融过程后,存活率却明显下降,除其毒性作用外,引起冻融后胚胎失活的因素主要有:   (二)细胞内冰晶形成   细胞的冷冻实际上是一个脱水过程,如果在投入液氮前胚胎能充分脱水,避免形成细胞内冰晶,是胚胎冻融后能存活的主要因素。   将胚胎放入保护剂溶液中,胚胎的变化首先是细胞外高渗溶液引起的细胞皱缩,然后随着保护剂进入细胞内,细胞再次膨胀,成功地冻存在于细胞脱水和保护剂渗入细胞两者之间达到平衡。因为脱水和渗透的程度将决定冷冻时细胞内的水量,因此决定了细胞内冰晶的形成。它受保护剂的浓度、平衡时的温度和停留时间的影响。   在慢速冷冻到-7℃ 时,必须协助细胞外冰晶形成,若细胞外培养液凝固,则造成细胞外环境低化学势能,因为液体能渗透过细胞膜,但细胞外凝固体则不能通过细胞膜,这就造成细胞内水份只能由内向外渗,从高化学势能部位流向低化学势能部位,并继续在细胞外凝结。因为凝固的速度很慢,水份由细胞内流向细胞外,将减低细胞膜内外的化学势能差,并达到细胞内脱水的目的。只有这样,才能导致胚胎在投入液氮前充分脱水。另一方面,充分脱水后,保护剂在胚胎内才能足够浓缩,在低温下,呈极其粘稠的固体状态,这种状态能保持其溶液的离子和分子分布,即呈玻璃化状态,从而达到冻存目的。   (三)渗透性休克   冻存胚胎刚解冻时,细胞内通常所含的渗透性保护剂浓度很高,可达2000 -3000mOsm/L或更高,若将此时的细胞从冷冻管直接置于渗透压为300mOsm/L的等张盐溶液中,此时大量水分快速进入细胞而保护剂却不能立即渗出即引起细胞急剧肿胀甚至破裂,这种现象称为渗透性休克。胚胎明显地不能耐受如此大而突然的跨膜渗透压差。研究大鼠的合子发现,在生理温度下,逐渐改变其容积,皱缩到正常体积的25%或肿胀到290%,然后恢复至正常可不影响其继续发育。容积变化的速度和变化时的温度较容积变化的大小对合子的发育更重要。   可以避免渗透性休克对胚胎的损害。通过在解冻液中加有不能渗入细胞的保护剂,使细胞外溶液与细胞内溶液等渗,这样,将胚胎放入非渗透性保护剂形成的渗透压缓冲液中,就不会因为细胞内含大量的渗透性保护剂而收入大量水份,因细胞外无渗透性保护剂,它可从胞内渗出,从而被稀释。   常用蔗糖等双糖溶液作为渗透压缓冲液,但已发现其有不足之处,当胚胎在其中停留时间延长,特别是温度升高时,若解冻过程在>25℃下进行时,它可漏入胚胎内,同时带入水份,这样使胚胎发生渗透性休克,妊娠率明显较低。   (四)解冻过程冰晶重新形成   解冻太快或太慢都会损伤胚胎。解冻太快易发生透明带破坏,所以从液氨中取出冷冻管后需要先在空中停留一定时间。但是如果解冻太慢,就会形成细胞内冰晶,快慢之间的合适速度的界线很窄,细胞内冰晶重新形成开始于-85℃到-70℃,所以把冷冻管在空气中摇动一定时间,当其温度接近-80℃时,就要立即换成更快速升温法,即将冻管置30℃水中。

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